Internal Control در ریل تایم پی سی آر (Real-Time PCR) چیست؟

Internal Control در Real-Time PCR چیست و چه خطاهایی را شناسایی می‌کند؟

در دنیای تشخیص مولکولی، دقت حرف اول را می‌زند. صحت نتایج آزمایش تنها به پیشرفته بودن دستگاه یا مهارت اپراتور بستگی ندارد؛ بلکه وجود سیستم‌های کنترل کیفی دقیق مانند Internal Control است
که اعتبار نهایی داده‌ها را تضمین می‌کند.

در این مقاله به بررسی عمیق نقش کنترل داخلی در واکنش‌های qPCR و Multiplex PCR می‌پردازیم.

Internal Control در Real-Time PCR چیست؟

Internal Control (IC) یا کنترل داخلی، یک توالی ژنتیکی مشخص و هدفمند است که به‌طور هم‌زمان با اهداف ژنتیکی اصلی در یک واکنش Real-Time PCR تکثیر می‌شود.
این توالی می‌تواند یک ژن مرجع انسانی (Endogenous)، یک RNA یا DNA سنتتیک اضافه شده (Exogenous) یا یک کنترل فرآیند باشد.

هدف اصلی از قرار دادن Internal Control در Real-Time PCR، نظارت بر تمام مراحل آزمایش از استخراج نوکلئیک اسید تا تکثیر و آشکارسازی است.
اگر سیگنال کنترل داخلی در خروجی دستگاه مشاهده نشود، نتیجه آزمایش حتی در صورت منفی بودن هدف اصلی، “نامعتبر” تلقی شده و باید تکرار گردد.

چرا Internal Control در qPCR ضروری است؟

بدون وجود یک کنترل داخلی استاندارد، نتیجه منفی در آزمایش PCR همیشه قابل اعتماد نیست. کنترل داخلی به آزمایشگاه کمک می‌کند تا مرز بین “منفی واقعی” و “خطای فنی” را تشخیص دهد.

مهم‌ترین دلایل ضرورت استفاده از Internal Control in qPCR عبارتند از:

1. بررسی موفقیت استخراج: اطمینان از اینکه DNA یا RNA با کیفیت کافی استخراج شده است.
2. شناسایی مهارکننده‌ها (PCR Inhibitors): تشخیص موادی که مانع فعالیت آنزیم پلیمراز می‌شوند.
3. تأیید عملکرد سیستم: اطمینان از صحت عملکرد مسترمیکس، پرایمرها و پروب‌ها.
4. جلوگیری از False Negative: کاهش ریسک گزارش نتایج منفی کاذب که می‌تواند برای بیمار خطرناک باشد.

چه خطاهایی توسط Internal Control شناسایی می‌شوند؟

استفاده از Internal Control در Real-Time PCR به اپراتور اجازه می‌دهد تا خطاهای زیر را به‌سرعت شناسایی کند:

۱. خطا در استخراج نوکلئیک اسید

اگر فرآیند استخراج به‌درستی انجام نشود یا نمونه حاوی مقدار کافی سلول نباشد، سیگنال کنترل داخلی ظاهر نخواهد شد.

۲. وجود مهارکننده‌های PCR (PCR Inhibitors)

بسیاری از نمونه‌های بالینی (مانند خون حاوی هپارین، نمونه‌های FFPE یا سواب‌های دهانه رحم) حاوی مهارکننده‌های طبیعی هستند.
Internal Control با عدم تکثیر یا تأخیر در سیگنال (Shift در Ct)، وجود این مهارکننده‌ها را فاش می‌کند.

۳. خطاهای انسانی و پیپتاژ

اشتباه در افزودن نمونه به چاهک یا نقص در ترکیب مسترمیکس باعث حذف سیگنال کنترل داخلی می‌شود و اپراتور را از بروز خطای فنی آگاه می‌سازد.

تفاوت کنترل داخلی با کنترل مثبت و منفی

برای دستیابی به بالاترین سطح استاندارد در آزمایشگاه، باید تفاوت این سه مورد را بدانید:

• Internal Control: بررسی کل فرآیند برای هر نمونه به‌صورت مجزا.
• Positive Control: اطمینان از عملکرد کلی کیت و دستگاه (صحت کلی واکنش).
• Negative Control (NTC): شناسایی آلودگی احتمالی در محیط آزمایشگاه یا مواد مصرفی.

یک کیت Real-Time PCR حرفه‌ای (مانند محصولات فرداد آزما راد) باید هر سه نوع کنترل را به‌صورت استاندارد در خود جای داده باشد.

نقش کنترل داخلی در کیت‌های Multiplex PCR

در تکنولوژی Multiplex PCR که چندین هدف ژنتیکی (Target) به‌طور هم‌زمان در یک تیوب بررسی می‌شوند، وجود Internal Control اهمیت دوچندان پیدا می‌کند.
به دلیل پیچیدگی واکنش و احتمال تداخل پرایمرها، کنترل داخلی تضمین می‌کند که منفی بودن تمامی اهداف، ناشی از نبود واقعیت ژنتیکی است، نه نقص در کارایی واکنش (Reaction Efficiency).

کاربرد در کیت‌های تشخیص مولکولی پیشرفته

کنترل داخلی در کیت‌های HPV و سرطان

در کیت‌های HPV Real-Time PCR، به دلیل وجود مهارکننده‌های طبیعی در نمونه‌های دهانه رحم، وجود کنترل داخلی برای جلوگیری از False Negative حیاتی است.
همچنین در کیت‌های تشخیص سرطان (مانند کیت‌های تشخیص جهش KRAS یا BRAF در نمونه‌های FFPE)، کنترل داخلی اعتبار نتایج را در بافت‌های آسیب‌دیده تضمین می‌کند.

کنترل داخلی در کیت‌های ویروسی و قارچی

در تشخیص ویروس‌هایی مثل HSV، EBV و CMV یا در کیت‌های Multiplex PCR تشخیص قارچ‌ها مانند Candida albicans، Candida glabrata و Candida parapsilosis، کنترل داخلی نقش کلیدی در اعتبارسنجی نتایج آزمایشگاهی ایفا می‌کند.
کیت Easy® THYROID یکی از کیت‌های Multiplex Real-Time PCR پیشرفته است که برای تشخیص هم‌زمان جهش‌های KRAS، NRAS، HRAS و BRAF در سرطان تیروئید طراحی شده است.
در این کیت، Internal Control به‌صورت هم‌زمان با جهش‌های هدف تکثیر می‌شود و امکان بررسی صحت استخراج، واکنش PCR و عدم وجود مهارکننده‌ها را فراهم می‌کند.

کیت‌های Real-Time PCR دارای Internal Control در فرداد آزما راد

شرکت فرداد آزما راد با ارائه مجموعه‌ای از کیت‌های
Multiplex Real-Time PCR دارای کنترل داخلی واقعی،
نیاز آزمایشگاه‌های تخصصی کشور را در حوزه سرطان، عفونت‌ها و ژنتیک پزشکی پوشش می‌دهد.

پیشنهاد ویژه: برای مشاهده و خرید کیت‌های Real-Time PCR دارای کنترل داخلی واقعی و بررسی مشخصات فنی آن‌ها، به بخش محصولات فرداد آزما راد مراجعه فرمایید.

جمع‌بندی

Internal Control در Real-Time PCR ستون فقرات یک آزمایش مولکولی معتبر است.
شرکت فرداد آزما راد با درک این اهمیت، تمامی کیت‌های تشخیصی خود را مجهز به کنترل‌های داخلی پیشرفته کرده است تا آزمایشگاه‌های کشور با اطمینان کامل نتایج خود را گزارش کنند.